凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24) 分子生物試劑
凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Performance
覆蓋基因組所有位點(diǎn)，十分適用于二代測序和其他下游應(yīng)用
REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增的DNA平均長度大于10 kb，并且覆蓋所有基因組位點(diǎn)。該產(chǎn)品已經(jīng)過驗(yàn)證，適用于二代測序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交（aCGH）和real-time PCR應(yīng)用等多種下游分析。使用該產(chǎn)品無需單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，減少了手動操作，獲得的產(chǎn)物長度PCR方法更長（參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods"）。用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測序，獲得高品質(zhì)結(jié)果。這表明該試劑盒的位點(diǎn)覆蓋率大，錯配率低，其擴(kuò)增的DNA（甚至從單一細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增的DNA）能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美（參見"Comparable NGS results"）。另有研究對人類常染色體和X染色體上的多個標(biāo)記物進(jìn)行了分析，三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均顯示：基因組的所有位點(diǎn)被成功擴(kuò)增，沒有遺漏任何一個位點(diǎn)（參見"Complete genome coverage"）。
REPLI-g Single Cell Kit的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒
其他供應(yīng)商的試劑盒基于PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物片段較短，帶有PCR引物序列，可能影響下游應(yīng)用?；赑CR的全基因組擴(kuò)增容易出現(xiàn)錯誤，會導(dǎo)致堿基對突變、STR的減少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶會導(dǎo)致位點(diǎn)缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能夠進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增，位點(diǎn)偏差小。對四個試劑盒進(jìn)行了檢測，其中兩個利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外兩個利用PCR技術(shù)。采用單一細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案對所有試劑盒進(jìn)行序列位點(diǎn)檢測。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應(yīng)商的試劑盒都出現(xiàn)了位點(diǎn)的遺漏（參見"Unbiased DNA amplification from a single cell"）。
凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Principle
REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase，這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化，促進(jìn)對所有位點(diǎn)的無偏差擴(kuò)增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞等單一細(xì)胞，能夠擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見表1）。此外，該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實(shí)驗(yàn)方案，可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產(chǎn)量可達(dá)40 µg，對模板的起始量要求低，因此進(jìn)行后續(xù)遺傳分析時(shí)無需檢測DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴(kuò)增產(chǎn)物平均長度超過10 kb，且覆蓋所有位點(diǎn)，適合于多種應(yīng)用，包括二代測序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交、焦磷酸測序和real-time PCR分析（參見表2）。
| 應(yīng)用 | 儀器 |
|---|---|
| 全基因組測序 | 二代測序平臺? |
| 外顯子組測序 | |
| SNP基因分型芯片 | 芯片平臺? |
| Array CGH | |
| qPCR/PCR技術(shù) | Real-time PCR/PCR儀? |
| Sanger測序 | 毛細(xì)管測序儀? |
| 焦磷酸測序 | PyroMark (QIAGEN) |
擴(kuò)增原理
REPLI-g Single Cell Kit采用等溫基因組擴(kuò)增技術(shù)，即多重置換擴(kuò)增（MDA）。六聚體與變性DNA隨機(jī)結(jié)合，然后在等溫條件下，在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)。每個置換后的單鏈作為模板，與引物結(jié)合，可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology"）。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中，能夠輕松的打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)，因此可促進(jìn)擴(kuò)增時(shí)聚合酶正常工作?？蓴U(kuò)增獲得長達(dá)100 kb的DNA片段（參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase"）。
細(xì)胞裂解和DNA的堿變性
基因組DNA在用于酶促擴(kuò)增反應(yīng)前必須經(jīng)過變性，而這一變性過程通常使用高溫或高pH值（強(qiáng)堿）孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用溫和的堿孵育，在細(xì)胞裂解、DNA變性的同時(shí)，確保DNA片段化程度小，不產(chǎn)生堿基突變。因此擴(kuò)增獲得的DNA完整度高，產(chǎn)物長度長，覆蓋位點(diǎn)多（參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。
高效去除可檢測到的DNA污染
REPLI-g Single Cell Kit中的所有組分都經(jīng)過了dute的去污染流程，避免擴(kuò)增產(chǎn)物被污染。在標(biāo)準(zhǔn)化流程中，對緩沖液和試劑進(jìn)行紫外線照射，確保其不會污染DNA（參見"Innovative decontamination procedure"）。紫外線照射后，對試劑盒的所有組分進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保其性能。
Procedure
簡單的單管操作
REPLI-g Single Cell Kit可對單一細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行簡便、可靠、準(zhǔn)確的全基因組擴(kuò)增。反應(yīng)體系構(gòu)建十分便利、可靠，僅需15分鐘左右的手動操作（參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure"）。專用的緩沖液和試劑可對單一細(xì)胞、有限的組織材料、或純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)量高、位點(diǎn)覆蓋率大（參見表3）。REPLI-g技術(shù)擴(kuò)增獲得的DNA可在–20°C長期儲存（參見"Consistent long-term stability"）。請參見表4，了解REPLI-g產(chǎn)品線的更多信息。
| 試劑盒成分 | 優(yōu)勢 |
|---|---|
| REPLI-g sc Polymerase | 最長可達(dá)70 kb的長片段 |
| 保真性是Taq聚合酶的1000倍 | |
| 覆蓋所有位點(diǎn) | |
| 均一擴(kuò)增所有位點(diǎn) | |
| REPLI-g sc Reaction Buffer? | 對所有位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增 |
| Buffer DLB （裂解和變性） | 高效擴(kuò)增 |
| 不損傷DNA | |
| 紫外線照射去除污染 | 減少可檢測到的殘留DNA污染 |
| REPLI-g Single Cell | REPLI-g Mini | REPLI-g UltraFast Mini | REPLI-g Midi | REPLI-g Screening | REPLI-g FFPE | REPLI-g Mitochondrial DNA | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 起始材料 | 單一細(xì)胞、gDNA | 純化的基因組DNA、血液、細(xì)胞 | 純化的基因組DNA、血液、細(xì)胞 | FFPE組織、FFPE組織中純化的基因組DNA | 純化的基因組DNA | ||
| 另外提供其他起始材料的實(shí)驗(yàn)方案 | |||||||
| 起始量 | 單一細(xì)胞、2–1000各細(xì)胞、組織、純化的gDNA （1–10 ng） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或細(xì)胞（>600個細(xì)胞/µl） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或細(xì)胞（>600個細(xì)胞/µl） | 組織切片（直徑1 cm，厚度10–40 µm）；>100 ng gDNA | >1 ng純化的gDNA | ||
| 產(chǎn)量（µg/反應(yīng)） | 40 | 10 | 7–10 | 40 | 8 | 標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)量：≤10; 高產(chǎn)量：≤40 | 3–5 |
| 反應(yīng)時(shí)間 | 8–16小時(shí) | 10–16 小時(shí) | 1.5小時(shí) | 8–16小時(shí) | 12–16小時(shí) | 標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)量：4小時(shí)；高產(chǎn)量：10小時(shí) | 8小時(shí) |
| 手動操作時(shí)間 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 40分鐘 | 15分鐘 |
| 規(guī)格 | 反應(yīng)管 | 反應(yīng)管 | 反應(yīng)管 | 反應(yīng)管 | 孔板 | ||
Applications
二代測序
采用TaqMan引物/探針對進(jìn)行的SNP基因分型
基于qPCR和PCR的突變檢測
STR/微衛(wèi)星分析
Sanger測序
焦磷酸測序
aCGH等芯片技術(shù)
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